PURIFICACION DE PROTEINAS

Purificación
Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentración diferencial de la proteína o molécula de interés.

Condiciones generales a evaluar
•Calidad(% de pureza del producto de acuerdo a mis objetivos)

secuenciación, cristalización
ensayo de actividad, productos alimenticios médicos
•Cantidad técnicas de alta capacidad y de baja capacidad

preparativas
analíticas
•Costos


Pasos a seguir en una purificación
1.Definir un ensayo específico que identifique a la proteína (actividad biológica) (específico, sensible, rápido y barato)
2.Elegir la fuente (matriz biológica)
3.Extraer la proteína de la fuente (proteínas intraceluares o extracelulares)
4.Estabilización de la molécula
5.Aislamiento y concentración(fraccionamiento)
6.Determinar la pureza y calidad del producto final


1 Actividad Biológica

Cantidad de proteína que produce, por su acción biológica, un determinado cambio.
Este cambio puede ser:
•Un efecto biológico (Muerte celular, hemólisis, protección inmunológica)
•Variación en la cantidad de una sustancia química (producto de una reacción)

De esta forma podemos definir a la unidad de actividad biológicacomo :
Una unidad de Actividad Biológicaes la cantidad de proteína que produce una determinada cantidad de "efecto"
1.Toxina

Una unidad de AB para una toxina es la cantidad de proteína que produce la muerte del 23% de los ratones de tal especie (siguen especificaciones…)
2.Enzima

Una unidad de AB para una enzima es la cantidad de proteína que produce 5.98 moles de producto en 1 minuto en condiciones …(siguen especificaciones…)


Aislamiento y concentración
Fraccionamiento del extracto crudo
•Implica una serie de pasos en los cuales se aprovechan propiedades fisicoquímicas o biológicas de la proteína de interés para separarla del resto de las moléculas
•Cada paso debe ser monitoreado adecuadamente para evaluar el rendimiento en la purificación, pureza y actividad específica decada fracción obtenida.
•Si bien no hay una sola secuencia de técnicas a seguir, en general se recomienda empezar por técnicas de alta capacidad y seguir con las de baja capacidad.
•En general se desea obtener una gran pureza (según los objetivos) acompañada de un gran rendimiento.